愈创木酚法测定过氧化物酶活性(准确,无误)

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愈创木酚法测定过氧化物酶活性(准确,无误)



愈创木酚法测定过氧化物酶活性



一、实验目的

过氧化物酶它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有亲近关系，在植物生长发育过程中，它的活性可以反响某一期间植物体内代谢的变化。经过本实验认识过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。



二、实验原理

在过氧化物酶（ POD）催化下， H2O2 将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产 物在 470nm 处有最大光汲取值，故可经过测

470nm 下的吸光度变化测定过氧



化物酶的活性。

三、实验资料 马铃薯块茎。 四、设备与试剂

分光光度计，离心计，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。

0.05 mol L·的磷酸缓冲液（）； 0.05 mol L·愈创木酚溶液； 2％H2O2；

20％三氯乙酸

五、实验步骤 （一）酶液的制备

取～5.0 g 洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适当的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液所有转入离心管中，于 3000×g离心 10 min，上清液转入 25 mL 容量瓶中。积淀用 5 mL 磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保留备用。



（二）过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反响系统：

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愈创木酚法测定过氧化物酶活性(准确,无误)



挨次加入 2.9 mL 0.05 molL-·1磷酸缓冲液； 1.0 mL2％H2O2；1.0 mL 0.05 mol ·L-1 愈创木酚和 0.1 mL 酶液。用加热煮沸 5 min 的酶液为比较，反响系统加入酶液后，马上于 34℃水浴中保温 3 min，而后迅速稀释 1 倍， 470 nm 波长下比

色，每隔 1 min 记录 1 次吸光度 A470，共记录 5 次，而后以每分钟内 A470 变 化 0.01 为 1 个酶活性单位（ U）。

六、实验结果

以每分钟内 A470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ U）。

△ A470× VT

过氧化物酶活性 (U·g-1 ·min-1)=──────

W× VS× 0.01 × t

式中：

△ A470——反响时间内吸光度的变化；

W——马铃薯鲜重（ g）；

t ——反响时间（ min）；

VT——提取酶液整体积（ mL）；

VS——测准时取用酶液体积（ mL）。

七、注意事项

酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。 H2O2要在反响开始前加，不可以直接加入。

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